AISLAMIENTO DE HERPESVIRUS CANINO ASOCIADO A COLIBACILOSIS
G. VILAR; J. HERRO1; P. RODRIGUE1, F. IRIBARREN- Noviembre 2005

RESUMEN: Se realizó la necropsia a un cachorro de Schnauzer miniatura, proveniente de una camada en la cual los cachorros habían muerto con signos previos de decaimiento durante la primera semana de vida. Se realizó un cultivo viral en células CrFK e improntas a partir de muestras de hígado y bazo, además de un cultivo bacteriológico a partir de sangre y pulmón. Se hallaron efectos citopáticos en la monocapa de células, confirmando la presencia de Herpesvirus canino mediante Inmunofluorescencia directa (IFd) y se encontraron cuerpos de inclusión Cowdry tipo A en la impronta de hígado. Por otro lado, logró aislarse Escherichia coli a partir de la muestra de pulmón, confirmándose su identidad mediante pruebas bioquímicas. En conclusión, logró aislarse una cepa de herpesvirus canino confirmada mediante inmunofluorescencia directa a partir de un caso diagnosticado clínicamente, al cual se lo encontró asociado a una colibacilosis.

Palabras clave: herpesvirus canino, aislamiento viral, colibacilosis, Giemsa, inmunoflorescencia directa.

INTRODUCCIóN: El herpesvirus canino (HVC), perteneciente a la familia herpesviridae, es un herpesvirus-alfa, por lo tanto, es sensible a los solventes lipídicos, e inactivado a temperaturas sobre 40ºC. Respecto al pH, es inestable entre pH de 5.0 y 8.0. Es totalmente inactivado a -20ºC, a no ser que se adicione soluciones estabilizadoras. También es rápidamente inactivado por los desinfectantes comunes. El virus se desarrolla solamente en células de origen canino, siendo más apropiadas las células primarias o secundarias de riñón o testículo, aunque también se desarrolla en diversas líneas caninas. El crecimiento óptimo es a 34 - 35ºC. En los cultivos celulares la mayoría de los aislamientos produce los típicos racimos de células redondeadas que se desprenden, dejando "placas claras". Al igual que el resto de los herpesvirus, produce cuerpos de inclusión intranucleares tipo A en las células infectadas.
La enfermedad causada por el HVC es generalmente fatal en los cachorros recién nacidos, sobre todo en cachorros que no han recibido inmunidad suficiente de parte de sus madres. Por otro lado, los cachorros recién nacidos poseen una temperatura corporal óptima para el desarrollo del virus. Estos se pueden contraer el virus durante su pasaje a través del canal del parto infectado de la perra o, más comúnmente, por contacto con secreciones oronasales de la madre o de otros perros de un criadero. Generalmente los cachorros que mueren son los de una o cuatro semanas de vida y que han adquirido el virus durante las dos primeras semanas, pues raramente mueren si la exposición al virus fue a partir de la tercera semana.
La replicación inicial viral ocurre en la mucosa nasal, la faringe y las tonsilas de los cachorros infectados. Los macrófagos son los encargados de llevar el virus a través de la sangre al hígado, riñones, tejido linfático, pulmones y el sistema nervioso central. El período de incubación es de aproximadamente seis a diez días, siendo los cachorros más afectados los que tienen de una a tres semanas de edad. Las muertes de camadas afectadas usualmente ocurren en un período de pocos días a una semana, siendo generalmente tanto la letalidad como la morbilidad del 100%. Los cachorros expuestos que tengan más de tres semanas de edad, como en los perros adultos, usualmente tienen infecciones inaparentes, no obstante pueden presentar signos nerviosos centrales, incluyendo la ceguera y la sordera relacionadas con el daño cerebral. En animales adultos puede presentarse vaginitis, conjuntivitis y enfermedad respiratoria.
Los cachorros afectados presentan anorexia, disnea, dolor a la palpación abdominal, incoordinación y, a menudo, heces blandas amarillo verdosas. Las petequias son frecuentes en las membranas mucosas y no hay hipertermia. El HVC puede ocasionalmente causar infecciones en el útero que resultan en la muerte de los fetos o cachorros poco tiempo después del nacimiento. Los perros infectados que no presentan signos, o las hembras que sufrieron infecciones en el útero, permanecen infectados en forma latente y el virus se puede excretar por aproximadamente 1 semana en las secreciones nasales o genitales, y después a intervalos impredecibles por períodos de varios meses o años. El virus latente puede ser provocado por el estrés (mudanza a un lugar nuevo, introducción de perros nuevos) o experimentalmente, por drogas inmunosupresoras (corticoesteroides). El virus latente, persiste en los ganglios trigéminos, pero en otros sitios como los ganglios lumbo-sacros, las tonsilas, y la glándula salivar parótida también han sido identificados.

MATERIALES Y MéTODOS: Se recibió en el laboratorio un cachorro Schnauzer miniatura, de 6 días de edad. Provenía de una camada de 6 cachorros que murieron entre los 3 y 5 días post-parto, presentando signos de decaimiento e hipotermia. Al morir tenían buen estado corporal y mantenían el reflejo de succión. Los animales pertenecían a un criadero, hijos de una madre que no presentaba sintomatología alguna, la cual también había perdido la totalidad de la camada anterior en los 7 días posteriores al parto con los mismos signos de decaimiento. Se le realizó un diagnóstico clínico de Herpesvirosis, por lo tanto se intentó realizar un aislamiento viral, además de un diagnóstico bacteriológico. El canino llegó en estado agónico, por lo que se procedió a realizarle una eutanasia. A la necropsia se observó en un lóbulo del hígado una zona ligeramente pálida en su cara diafragmática y congestión en la zona umbilical. El resto de los órganos se encontraban sin lesiones aparentes. Se tomaron de rutina muestras de sangre mediante punción cardíaca y pulmón para cultivo bacteriológico. También se realizaron improntas de hígado y bazo que se fijaron en alcohol metílico y fueron teñidas con la coloración de Giemsa. Además se tomaron muestras de dichos órganos, los cuales fueron conservados a 4ºC para realizar el aislamiento viral.
Aislamiento viral.
A partir de las muestras de hígado y bazo se realizaron cortes con tijera para obtener el inóculo, completando su tratamiento con un pasaje por el homogeneizador. Luego se centrifugó a 2500 rpm durante 8 minutos y en un flujo laminar se procedió a pasar el sobrenadante a través de un filtro milipore de 0,2 . El inóculo así conformado se lo sembró en una monocapa de células Crandell Feline Kidney (CrFK) con un 70% de desarrollo en medio 41500 con el agregado de 2% de suero fetal bovino y PSN (penicilina-estreptomicina-neomicina). Se incubó a 28ºC, junto a un control negativo de iguales características. Al realizar la lectura de las monocapas, se notó al 5º día redondeamiento celular y la aparición de células gigantes en aquella que estaba inoculada con la muestra proveniente de hígado. Luego se realizó un pasaje ciego a partir del sobrenadante de ambos cultivos celulares, observándose los mismos efectos a los 3 días solamente en el de hígado. Se siguió observando hasta el 5º día, hallándose placas de lisis y desprendimiento de pequeños sectores de la monocapa. Se conservó el sobrenadante de los tres cultivos y se procedió a desprender las monocapas mediante agitación vigorosa. Estas se centrifugaron levemente a 2500-3000 rpm durante 5 minutos y el sedimento fue sembrado en slides, dejando secar las células en estufa a 37ºC durante 1 hora. Se realizó a continuación una inmunofluorescencia directa con conjugado específico para herpesvirus canino (Canine Herpesvirus (CHV) Direct FA Conjugate - VMRD, Inc -catalog NO.: 210-12-CHV) en los tres slides.

Aislamiento bacteriológico
Las muestras provenientes de punción cardíaca y pulmón fueron sembradas en un agar triptosa e incubados durante 24 horas a 37 grados celsius. Se encontraron colonias compatibles con enterobacterias de la muestra de pulmón, no presentando desarrollo bacteriano el cultivo sanguíneo. A la tinción de Gram se encontraron bacilos negativos y se les realizaron las siguientes pruebas bioquímicas: movilidad, lactosa, ureasa, producción de SH2, fenilalanina, indol y citrato.

RESULTADOS: Aislamiento viral: Se hallaron cuerpos de inclusión Cowdry tipo A en la impronta de hígado teñida con Giemsa y no en la de bazo. Se logró realizar el aislamiento viral a partir de la muestra de hígado, obteniendo los típicos efectos citopáticos (redondeamiento celular, presencia de células gigantes y placas de lisis) que producen los herpesvirus. Se confirma la identidad del herpesvirus canino mediante la IFd, en donde se observó positividad únicamente en el cultivo de hígado, no así en el cultivo de bazo y el control negativo, en los cuales tampoco se observaron efectos citopáticos.
Aislamiento bacteriológico: Las colonias desarrolladas fueron identificadas como bacilos Gram negativos, las cuales dieron los siguientes resultados mediante las pruebas bioquímicas: Lactosa (+), ureasa (-), movilidad (+), producción de SH2 (-), Indol (+), citrato (-) y fenilalanina (-). De esta manera confirmamos la presencia de Escherichia coli.

DISCUSIóN: A partir de un caso en un criadero de schnauzer miniatura, en el cual se hizo un diagnóstico clínico de herpesvirosis, se logró aislar una cepa de herpesvirus canino. Cabe mencionar que ésta es una enfermedad que sólo es diagnosticada clínicamente y mediante inmunofluorescencia indirecta (IFi); por lo tanto, es la primera vez en Argentina que este virus es aislado con la posterior confirmación mediante IFd. Por otro lado, el hecho de tener aislada la cepa del virus que en estos momentos está afectando a los criaderos, nos da la posibilidad de desarrollar vacunas a partir de una cepa nacional de campo.
En cuanto al diagnóstico bacteriológico, del cachorro en estudio se aisló un microorganismo a partir de pulmón, que mediante pruebas bioquímicas se llegó a identificar como Escherichia coli. Cabe destacar entonces la importancia de la inmunosupresión debida al virus, que permite la infección por microorganismos comunes por distintas vías, en este caso, posiblemente por vía onfalógena.

BIBLIOGRAFíA

1. Carmichael L. - Neonatal Viral Infections of Pups: Canine Herpesvirus and Minute Virus of Canines (Canine Parvovirus-1). In: Recent Advances in Canine Infectious Diseases (Last Updated: 19-Aug-2004).
2. Iribarren F. E.; Boviez J.; Menchaca E. S.; Barboni de Stella A. M.; Marenda H.; y Moras E. V. - Herpesvirosis en cachorros recién nacidos: Hallazgos clìnicos y anotomopatológicos. 1998 - Presentado en el VI Congreso Argentino de Ciencias Veterinarias, organizado por la Sociedad de Medicina Veterinaria, del 22 al 26 de agosto.
3. Morresey P R. - Reproductive Effects of Canine Herpesvirus - BVSc, MACVSc, DACT, DACVIM University of Pennsylvania - COMPENDIUM - October 2004
4. Poste, G; King, N. - Isolation of a herpesvirus from the canine genital tract: association with infertility, abortion and stillbirths. - Vet Rec. 1971 Feb 27; 88(9): 229-33
5. Prydie, J.; Harrison M.J.; Graham J. - Isolation of a canine herpes virus - Vet rec 1966 Nov 26; 79(22): 660-1