Comparación de las pruebas de Inmunodifusión del Gel de Agar con Antígeno de Brucella ovis y de Aglutinación en Placa con Brucella canis M(-) para en el diagnóstico de la Brucelosis canina.
F. Iribarren*, J. Breglia*, M. Castillo*, V. Escobar* , F.Hoffman*, D. Marticorena** y E.V.Moras** - Mayo de 1999

Resumen:
La brucelosis canina producida por Brucella canis es una patología de singular importancia no solamente en los criaderos de razas puras sino también en la clínica diaria, debido a las pérdidas económicas que ocasiona no debiendo olvidar su característica zoonótica.
Hasta el presente el método de diagnóstico serológico empleado rutinariamente es la Inmuno-difusión en gel de agar con antígeno de Brucella ovis. Sin embargo esta técnica requiere una incu-bación de 48 horas y su lectura e interpretación requiere de personal relativamente especializado. La técnica de aglutinación en placa con antígeno de Brucella canis se presenta como una alternativa al diagnóstico tradicional, ya que requiere sólo unos minutos para su realización y su lectura es más simple. Sea cual fuere la técnica empleada se recomienda realizar diagnóstico etiológico por medio de hemocultivo de los animales serológicamente positivos .
Se concluye que la técnica de aglutinación el Brucella canis M (-) presenta una alta correla-ción con la técnica de inmunodifusión en agar con Brucella ovis. La técnica de aglutinación por su rapidez es a criterio de los autores la prueba tamiz de elección para seleccionar los animales negati-vos, debiendo confirmarse por hemocultivo los positivos. Palabras cables: Brucelosis canina, diagnóstico, aglutinación, inmunodifusión

Comparison between Agar Gel Precipitation Test with Brucella ovis antigen and the Agglutination Test with Brucella canis M (-) for the diagnostic of canine Brucellosis.

Summary:
Canine brucelosis produced by Brucella canis is a pathology of real importance, not only for the breeders but also in the daily clinic. Canine brucelosis is not only an important disease for the eco-nomics loses but also must be consider a zoonotic disease.
Up the present the most commonly diagnostic procedure is the agar gel precipitation test with Bru-cella ovis antigen. This technique needs an incubation time of 48 Hs and the lecture must be done by well trained personnel. The slide agglutination test with antigen of Brucella canis is a good al-ternative methodology. The test consumes only a few minutes and the lecture is quite simple. Any-way whatever is the methodology used for the serological diagnostic, it is recommended to confirm it due a haemoculture of the positive animals.
We can concluded that the agglutination test using Brucella canis M(-) shows a high correlation with the agar gel precipitation test wiht Brucella ovis antigen. The authors beleive that the aggluti-nation test is the screening technique of choice in order to select the negative animals, but the posi-tive ones must be confirmed by haemoculture.
Key words: Canine brucelosis, diagnostic, agglutination, inmunodifussion.

*División Diagnóstico y Servicio Técnico de Instituto Rosenbusch S.A. ** Area de Enfermedades Infecciosas, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad de Buenos Aires, Chorroarín 280 Buenos Aires. Tel (11) 4524-8407.

Introducción:
La Brucelosis canina es una enfermedad infecciosa que incolucra tanto a la Medicina Veteri-naria como a la Salud Pública. La infección de los caninos produce no solo fallas reproductivas ma-nifestadas como abortos, sino tambien perdida económica en los criaderos que la padecen. A esto se le debe sumar el riesgo de infección al humano, donde la convivencia del canino y el hombre es muy cercana.

La brucelosis canina es una patología infecciosa de los canidos de distribución mundial. El primer aislamiento de Brucella canis fue en 1966 en los Estados Unidos en una perra Beagle. A partir de esta fecha se aisló el mismo agente en perros de cría en todo el mundo.

Siendo producida principalmente por Brucella canis, sus hospedadores mas frecuentes son los caninos sexualmente maduros en los que pueden o no aparecer los signos clínicos. La enfermedad es de características crónicas. En las perras se observan abortos en el último tercio de la gestación y en los machos esterilidad. Los animales infectados son inútiles para la reproducción por el resto de su vida. El microorganismo se multiplica en el útero pero no necesariamente provoca un aborto, en el macho produce una vesiculitis y/o una epididimitis.

El método de diagnóstico de certeza es el aislamiento del microorganismo en medios bifásicos enriquecidos a partir de sangre, semen, secreciones vaginales o fetos. El hemocultivo es muy útil ya que la bacteriemia es constante en los caninos. Los métodos serológicos son ampliamente utilizados por su practicidad pero el principal inconveniente de estas técnicas es la posibilidad de obtener re-sultados falsos positivos.

En este ensayo se decidió comparar el método de inmudifusión en gel de agar utilizando antí-genos protoplasmáticos solubles de Brucella ovis frente a de aglutinación en placa con antígeno total de Brucella canis cepa M(-).

Materiales y métodos:
Sueros: las muestras de sangre fueron remitidas a la División Diagnóstico del Instituto Rosenbusch a lo largo de 1998, provenían de criaderos de caninos con problemas de infertilidad, abortos y mor-talidad perinatal. El día de su llegada fueron centrifugadas, se extrajo el suero y éstos fueron proce-sados. Se conservaron alícuotas de los mismos a - 20 °C en crioviales.

Antígenos: el antígeno de inmunodifusión de Brucella ovis fue provisto por la CoNEA y el DI-LAB-SENASA. El antígeno de Brucella canis fue elaborado en nuestro laboratorio con la cepa M(-) de Brucella canis, según la técnica del Dr. Leland Carmichael (comunicación personal).

Técnicas serológicas:

A) Aglutinación en placa con antígeno de Brucella canis

1. Se colocan 25 µl del suero problema sobre el vidrio de un aglutinoscopio previamente calentado a 20°C.
2. Se agrega 25 µl de una solución de 2-Mercaptoetanol 0,2 M.
3. Se mezcla con una escobilla plástica.
4. Se espera 1 minuto.
5. Se agrega 50 µl del antígeno de Brucella canis.
6. Se mezcla con una escobilla plástica.
7. Se ejercen movimientos rotatorios con la paca de vidrio.
8. Se espera 1 minuto.
9. Se lee utilizando una luz blanca tangencial sobre fondo negro.

Interpretación de los resultados
NEGATIVO: Se observa el líquido rosado homogéneo
POSITIVO: Se observan grumos rosados sobre el fondo translúcido

B) Inmunodifusión en gel de agar con antígeno de Brucella ovis

Según técnica de la OMS-CEPANZO.

C) Hemocultivo:

Cultivo bacteriológico: las muestras de sangre para hemocultivo se tomaron por venopunción de la vena cefálica antebraquial con jeringa heparinizada. De cada canino se extrajo sangre en 3 oportu-nidades en días alternos y procesadas por separado.
Las muestras se sembraron en caldo triptosa e incubados a 37 °C durante 7 días y se realizaron sub-cultivos en agar triptosa. Las placas de agar se incubaron a 37 °C durante 7 días.
Las colonias de Brucella spp. recuperadas se tipificaron según Alton y col.

Resultados

Durante 1998 se procesaron 1148 sueros provenientes de Capital Federal, Gran Buenos Aires y de la ciudad de Rosario, Pcia. de Santa Fe. 161 animales (14%) resultaron positivos a la prueba de aglutinación en placa con antígeno de Brucella canis y 154 (13,4 %) resultaron positivos a la prueba de Inmunodifusión en gel de agar con antígeno de Brucella ovis (cuadro 1). Todas las muestras po-sitivas a la inmunodifusión resultaron positivas a la aglutinación, mientras que sólo 7 muestras re-sultaron positivas a la segunda y negativas a la primera.
Se realizó hemocultivo de 38 animales que resultaron positivos a ambas reacciones y de 4 animales que sólo reaccionaron a la aglutinación. En 37 de los primeros (94,8 %), se determinó la presencia de Brucella canis. En ninguno de los positivos a la aglutinación y negativos a la inmunodifusión se logró recuperar el agente (cuadro 2).
El análisis estadístico reveló que no existen diferencias significativas entre ambos métodos con un nivel de significación del 0,01%.

Cuadro 1: animales positivos a las reacciones de aglutinación en placa con antígeno de Brucella canis y de Inmunodifusión en gel de agar con antígeno de Brucella ovis

Cuadro 2: Resultado de los hemocultivos realizados

Conclusiones:
Del presente estudio surge un alto grado de correlación entre las dos metodologías utilizadas. Tanto la inmunodifusión en gel de agar con antígeno de Brucella ovis como la aglutinación en placa con antígeno de Brucella canis presentaron una buena correlación con la recuperación de Brucella en hemocultivo. Solamente en 5 de los animales estudiados no se pudo recuperar el agente etiológico.
Podemos concluir que ambos métodos son útiles para el diagnóstico serológico de la Brucelosis en caninos siempre que el mismo se confirme por medio del hemocultivo, que en definitiva es único método que permite realizar el diagnóstico etiológico de la enfermedad.

Bibliografia:

• "Manual de normas para las pruebas de diagnóstico y las vacunas para las enfermedades de las Listas A y B de los mamíferos, pájaros y abejas". O.I.E. (1996) pág. 34 a 43.

• ALTON G.G.- JONES L.M. - PIETZ D.E.. "Las técnicas de laboratorios en la Brucelosis". Se-gunda edición. Organización mundial de la salud. Ginebra (1978)
• GARCíA - CARRILLO. "Pruebas suplementarias para el diagnóstico de la brucelosis". Nota téc-nica N°25 Centro Panamericano de Zoonosis. OPS-OMS. 1982.
• "Brucelosis. Técnica de difusión en agar para el diagnóstico de la epididimitis de los carneros". Nota Técnica N° 20. Organización Panamericana de la Salud