DETERMINACION DE LA PERSISTENCIA DEL VIRUS PESTE PORCINA CEPA CHINA Y SU DIAGNOSTICO DIFERENCIAL CON EL VIRUS CAMPO LUEGO DE LA VACUNACION EN CERDOS LIBRES DE ANTICUERPOS
Barboni M.,* Iribarren F.,**, Sobrero M.,***, Hoffman F.,** Moras E.,* - Julio de 2000
*Area de Enfermedades Infecciosas, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad de Buenos Aires, Chorroarín 280 ( ....) Buenos Aires
** Instituto Rosenbusch S.A. de Biología Experimental Agropecuaria. San José 1469 (1136) Buenos Aires.
*** DILACOT SENASA

INTRODUCCION:
Durante varios deceniso la Peste Porcina Clásica (PPC) ha constituido la entidad dominante de la Patología infecciosa porcina en razón de su gran contagiosidad, distribución mundial y su tasa de mortalidad.La aplicación sistemática en numerosos países de medidas médicas y sanitarias de lucha contra esta infección ha reducido su incidencia. Sin embargo ella se mantiene como una amenaza potencial permanente para el ganado porcino en diversas regiones.Su importancia se pone de relieve a través de las pérdidas económicas que entraña ya sea sus formas agudas, subagudas, crónicas o subclínicas.El virus de la PPC al igual que el de la Enfermedad de las Mucosas o Diarrea Viral Bovina (BVD) y el de la enfermedad de las fronteras (BDV) pertenecen a la familia Flaviridae, género Pestivirus y están relacionados entres sí de manera estrecha antigénica y estructuralmente.

Las infecciones congénitas con BVD y BDV en cerdos no son diferenciables de las producidas por PPC y han sido reportadas por varios autores (1,2,3). El virus de la PPC tiene un marcado tropismo por los epitelios y la criptas tonsilares son uno de los lugares que ofrecen el mejor material para su detección en cerdos vacunados con cepas vivas modificadas en cultivos celulares o lapinizadas (cepas “C” o “Chinas”), se puede detectar su presencia en tonsilas por un período variable de hasta dos semanas por la técnica inmunofluorescencia directa (4,5). Esta técnica emplea conjugados policlonales conjugados con isotiocianato de fluoresceína, preparados en lechones libres de patógenos específicos (SPF), inoculados con PPC o bien en conejos aplicando virus inactivados con adyuvante de Freund.

Estos anticuerpos policlonales y debido a la similitud antigénica de los tres virus del género Pestivirus, no pueden diferenciarlos.Con el advenimiento de los anticuerpos monoclonales (MAb) y su aplicación en virología se ha obtenido un panel de ellos que puede diferenciar uno de los otros. Así mismo pueden marcarse diferencias de las cepas de campo de PPC respecto de la vacunales.El MAb 63.19 utilizado en este ensayo confirma la presencia de cepas vacunales lapinizadas (Cepas Chinas “C” entre ellas la Brescia), la Thiverval, la Kubin y la deleteada en la glicoproteína E (GPE-), mientras que no detecta el virus campo.El MAb 44.13 reconoce específicamente estas últimas y no reconoce las cepas vivas vacunales.

Por otra parte los anticuerpos monoclonales se consiguen comercialmente conjugados con peroxidasa del rábano para poder realizar una técnica de inmunoperoxidasa (IP) con el fin de detectar la presencia de antígeno en los tejidos examinados.La conjunción de ambas metodologías (IFD e IP) brindan una herramienta interesante para el diagnóstico preciso de la presencia de PPC. También son indispensables para la implementación de un plan de control y erradicación de PPC.Finalmente las técnicas de diagnóstico sumadas a la utilización de inmunógenos de probada eficacia a nivel mundial como la cepa china “C” de PPC permitirán el control de esta enfermedad clasificada dentro de la lista “A” de la OIE.

El virus de la peste porcina clásica (PPC), el virus de la diarrea viral bovina (BVD) y el virus de la enfermedad de la frontera (BDV), pertenecen a la familia Togaviridae, género Pestivirus y están estrechamente relacionados antigénicamente y estructuralmente. La infecciones congénitas con BVD y BDV en cerdos son no diferenciables de las producidas por PPC y han sido reportadas por varios autores (1.2.3.)

El virus de la PPC tiene un tropismo por los epitelios y la criptas tonsilares son uno de los materiales de elección para su detección. A los cerdos vacunados con cepas vivas modificadas en cultivos celulares o lapinizadas (chinas) se les puede detectar la presencia de la cepa vacunal en las criptas tonsilares por un período variables de hasta 2 semanas por la técnica de inmunofluorescencia (IFD) (4.5) La IFD emplea conjugados de sueros policlonales con isotiocianato de fluoresceína preparados en cerdos libres de patógenos específicos infectados con PPC o bien en conejos con virus inactivados purificados y adyuvantes de Freund. Estos anticuerpos al ser policlonales y debido a la similitud antigénica de los tres virus del género Pestivirus no pueden ser diferenciados por IFD.Con el advenimiento de los anticuerpos monoclonales (MAb) y su aplicación a los Pestivirus se han obtenido una batería de ellos que pueden diferenciar PPC de los virus BVD y BDV, y aún más ya que pueden diferenciar las cepas de campo de PPC de las vacunales. El MAb 63.19 utilizado en este ensayo confirma la presencia de cepas vacunales como las Lapinizadas (cepas chinas, entre ellas la Brescia), la Thiverval, la Kubin y la deleteada en la glicoproteína E (GPE-), y no detecta las cepas de campo. El MAb 44.3 reconoces específicamente las cepas de campo de PPC y no reconoce a las cepas vivas vacunales. Estos MAb se consiguen comercialmente conjugados con peroxidasa del rábano para poder realizar una técnica de inmunoperoxidasa (IP) con el fin de detectar antígeno en los tejidos examinados.La conjugación de ambas metodologías IFD e IP son herramientas de gran utilidad para el diagnóstico preciso de la presencia de PPC. Estas herramientas son indispensables frente a un plan de control erradicación de la PPC.Las técnicas de diagnóstico sumadas a la utilización de inmunógenos de probada eficacia a nivel mundial como la cepa china de PPC permitirá el control de esta patología clasificada dentro de los patologías clase A por la OIE.

MATERIAL Y METODOS:

• Animales: Se utilizaron cerdos híbridos comerciales, cruza de Landrace con Yorkshire, de 60 días de edad, libres de anticuerpos contra la Peste Porcina Clásica y negativos a la prueba de inmunofluorescencia en tonsilas a la prueba de Peste Porcina Clásica. Se utilizaron 20 animales hembras. Todos los animales se identificaron con el sistema de indentificación electrónica Rosenbusch en la oreja izquierda por debajo del cartílago escutiforme. Luego de su identificación se leyeron y se distribuyeron en tres lotes al azar,ubicando 8 en el lote testigo (A), 6 en el lote vacunado con vacuna diluida 1/10 (B) y 6 con vacuna sin diluir (C).
• Campo experimental: La prueba se realizó en el campo experimental del Instituto Rosenbusch S.A. sito en la localidad de Uribelarrea, Provincia de Buenos Aires. Los tres lotes de animales se mantuvieron separados en tres corrales con alambrado perimetral, piso de cemento y recibieron alimentación ad libitum durante toda la experiencia.
• Vacunación: Se utilizó una vacuna comercial (Vacuna contra la Peste Porcina cepa china Rosenbusch) lapinizada, cepa Bresica, producida en conejos y aprobada por el SENASA. La vacuna liofilizada se reconstituyo con el diluente y se aplicó una dosis (2 ml) por vía intramuscular en el muslo al lote (C), luego se diluyó 1 en 10 con diluente y se aplicó una dosis de 2 ml al lote (B).
• Toma de muestras: Se tomaron muestras de tonsilas utilizando un abreboca tipo lira y una pinza de cuello uterino. Las muestras se ubicaron en frascos plásticos de boca ancha y se mantuvieron congeladas a –20°C hasta el momento de su procesamiento. En el mismo momento se sangraron los animales de vena cava para titular los anticuerpos anti peste porcina por el método de ELISA.Los animales se muestrearon de acuerdo al siguiente esquema.

* Los animales se sacrificaron previa sedación con xilazina por degüello. Se tomaron muestras de ambas tonsilas. Las muestras se conservaron congeladas hasta su procesamiento.

Dí;a 0 = dí;a de la vacunació;n

Procedimiento de laboratorio: Todas las muestras se procesaron en crióstato, marca....., congelando las piezas a ­40°C y cortando preparados de 4 µ. Las tonsilas se cortaron en forma longitudinal. Todas las muestras se procesaron por la técnica de inmunofluorescencia directa (IFD) con anticuerpos policlonales utilizando un conjugado comercial anti Peste Porcina Clásica de Laboratorios ID-DLO Holanda. Todas las muestras positivas se procesaron por la técnica de inmunoperoxidasa (IP) utilizando anticuerpos policlonales y monoclonales Ceditest de laboratorios ID-DLO Lelystad Holanda. El flujograma seguido fue el siguiente: IFD se utilizo Un suero policlonal comercial conjugado con isotiocianato de fluoresceína.
IFD negativa se considera al animal como negativoIFD positiva se considera al animal como positivo a Togavirus Pestivirus (el conjugado no diferencia PPC, BVD ni BDV).
Los cortes criostáticos se montaron en portaobjetos de vidrio, se fijaron con acetona a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego se enmarcó en corte utilizando pintura correctora de escritura blanca y se agregaron 20 µl de conjugado en dilución de uso. Se incubaron en cámara húmeda a 37°C y luego se lavaron con PBS pH 7.2 tres veces. Los preparados se leyeron en un microscopio de epifluorescencia marca........... con lámpara halógena a 100 y 400 X. Se incluyeron controles positivos (a cepa PPC campo y vacunal otorgados por el SENASA) y negativos para validar la lectura. La presencia de fluorescencia verde citoplasmática difusa fue considerada como positiva. IP Todas las muestras con resultado positivo a IFD se procesaron por este método utilizando los siguientes antisueros: PAb: anticuerpo policlonal conjugado con peroxidasa utilizado para confirmar el diagnóstico de IFDMAb 21.2 : anticuerpo monoclonal conjugado con peroxidasa que reconoce únicamente al virus de la PPC y no a los virus de BVD y BDV. No diferencia la cepa china de PPC de la cepa de campo.MAb 44.3: anticuerpo monoclonal conjugado con peroxidasa que reconoce únicamente a la cepa de campo de PPC y no a la cepa china de PPCMAb 63.19 anticuerpo monoclonal conjugado con peroxidasa que reconoce únicamente a la cepa china de PPC y no a la cepa de campo de PPC, se utilizo para confirmar la presencia de cepa china de PPC en la muestra.

Los cortes se fijaron con acetona a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego se secaron al aire. Se prepararon las soluciones de trabajo de los conjugados con PBS + 0.01% de Tween 80 y 5% de suero equino (pH 7.6). Los cortes se enmarcaron utilizando pintura correctora de escritura blanca, se hidrataron con PBS y se les aplicó en conjugado. Se incubaron en cámara húmeda una hora a 37 °C. Luego se lavaron 6 veces utilizando PBS 0.5 % de Tween 80. Luego se aplicó el cromógeno ( 3-amino-9-ethyl carbazole en buffer acetato de sodio 0.05M pH 5.0 y agua oxigenada), éste se dejo actuar durante 10 minutos. La reacción se frenó lavando el preparado 6 veces con PBS 0.05% de Tween 80 y un último lavado con buffer 0.05 M de acetato de sodio en agua destilada. Los preparados se leyeron utilizando un microscopio marca.............. examinado los mismos a 100x y 400x. La presencia de un precipitado colorado amarronado en el citoplasma de las células se consideró como positivo. Se incluyeron controles positivos (a cepa PPC campo y vacunal otorgados por el SENASA) y negativos para validar la lectura Muestras control positiva a virus campo PPC: tonsilas provenientes de cerdos inculados con virus campo PPC entregados por el SENASAMuestras control positiva a cepa china PPC: tonsilas provenientes de cerdos vacunados con 100 dosis vacunales y tomadas a las 48 horas post vacunación.Muestras control negativas: tonsilas provenientes de cerdos no vacunados y serológicamente negativos El esquema utilizado para la interpretación de los resultados fue el siguiente.

Resultados

N negativoP positivo a cepa PPC campoCH cepa chinaBVD Virus diarrea viral bovina CONCLUSIONES: La presencia de dos cerdos positivos al virus de la diarrea viral bovina coincide con el ingreso de un lote de terneros de raza holando argentino al campo experimental. Del estudio seroló;gico el 2 de los 16 de los animales no presentaron anticuerpos al virus de BDV, por la té;cnica de inmunofluorescencia indirecta. Ambos animales fueron positivos al ensayo de ELISA para la detecció;n de antí;geno BVD en sangre (ELISA Ingezim BVD das)